Pepsin je ključni enzim u probavnom sustavu, prije svega proizveden u stomaku. Igra značajnu ulogu u razbijanju proteina u manje peptide, olakšavanje apsorpcije tijela bitnih hranjivih sastojaka. Kao PEPSIN dobavljač, razumijevanje metoda za otkrivanje nivoa Pepsina nije korisno samo za kontrolu kvaliteta, već i za pružanje vrijednih informacija našim kupcima. U ovom blogu istražit ćemo različite metode za otkrivanje nivoa Pepsina.
1. Spektrofotometrijske metode
Spektrofotometrija je široko korištena tehnika za otkrivanje nivoa Pepsina. Ova se metoda temelji na principu da Pepsin može katalizirati hidrolizu specifičnih supstrata, a promjena apsorpcije reakcijske smjese s vremenom može se mjeriti.
Jedna zajednička supstrata koja se koristi u spektrofotometrijskim ispitivanjima je hemoglobin. Kada Pepsin djeluje na hemoglobinu, on prekida proteina u manje fragmente. Reakcija se obično vrši u kiselim pH (oko pH 2), što je optimalno pH za Pepsin aktivnost. Nakon određenog vremena reakcije, reakcijsku smjesu dodaje se trihloroocetska kiselina (TCA) da bi se reakcijska smjesa precipitala neprilagođeni protein. Apsorbancija supernatantnog, koja sadrži probavljene peptide, zatim se mjeri na određenoj talasnoj dužini (obično 280 Nm). Povećanje apsorpcije proporcionalno je količini Pepsina prisutnog u uzorku.
Druga podložna supstrata koja se može koristiti je Casein. Slično je i hemoglobinom testu, Pepsin Hydrolyzes Casein na manje peptide. Reakcija se vrši i kod kiselog pH, a izmjere se apsorbancija probavljenih proizvoda. Spektrofotometrijske metode su relativno jednostavne, brze i mogu pružiti kvantitativne rezultate. Međutim, mogu utjecati na nečistoće u uzorku i prisutnosti drugih enzima ili tvari koje se mogu apsorbirati na istoj talasnoj dužini.
2 Fluorometrijske metode
Fluorometrijske metode nude veću osjetljivost u odnosu na spektrofotometrijske metode. Ove metode se temelje na korištenju fluorescentnih podloga koje se cijepljuje Pepsin, što rezultira promjenom intenziteta fluorescencije.
Jedan primer fluorescentne supstrate je fluorescein izotiocijanat (fitc) -Labeed Casein. Kada se Pepsin hidrolizira kasein na emitiranju fita, fluorescentni fragmenti se oslobađaju u rješenje, a intenzitet fluorescencije se povećava. Reakcija se prati u realnom vremenu koristeći fluorometar, a stopa povećanja fluorescencije proporcionalna je aktivnosti Pepsin.
Fluorometrijske metode su vrlo osjetljive i mogu otkriti niske razine pepsina. Oni su takođe manje pogođeni u apsorpciji pozadine u odnosu na spektrofotometrijske metode. Međutim, oni zahtijevaju specijalizirana oprema (fluorometri) i fluorescentne podloge, što može biti skuplje.
3. Imunološke metode
Imunološke metode, kao što su imunozorbentna ispitivanja povezane sa enzimom (ELISA), zasnivaju se na specifičnom vezivanju antitijela u Pepsin. Elisa se može koristiti za otkrivanje i koncentracije i aktivnosti Pepsina.
U sendviču Elisa, uhvatljivo antitijelo specifične za Pepsin imobilizirano je na čvrstoj površini (npr. Dobro mikrom). Uzorak koji sadrži Pepsin se zatim dodaje u bunar, a Pepsin se veže za uhvaćeno antitijelo. Nakon pranja za uklanjanje nevezanih tvari, dodaje se antitijelo otkrivanja s enzimom (kao što je hren peroksidaza). Antitilo za otkrivanje veže se na drugi epitop na molekuli Pepsin. Zatim je dodana supstrat, a enzim katalizira reakciju koja proizvodi promjenu boje. Intenzitet boje proporcionalan je količini Pepsina u uzorku.
Imunološke metode su vrlo specifične i mogu razlikovati Pepsin iz drugih proteina. Oni se mogu koristiti i za mjerenje nivoa Pepsina u složenim biološkim uzorcima, poput krvi ili pljuvačke. Međutim, oni zahtijevaju razvoj specifičnih antitijela i mogu biti dugotrajni i skupi.
4. Zimografija
Zimografija je tehnika koja omogućava vizualizaciju Pepsin aktivnosti u gel matrici. U ovoj metodi, uzorak koji sadrži Pepsin učita se na poliakrilamidni gel koji sadrži supstrat, poput gelatina ili kazeina. Nakon elektroforeze, gel se inkubira u odgovarajućem međuspremniku kod kiselog pH kako bi se Pepsin omogućilo hidrolizaciju podloge. Gel je tada obojen mrljama proteina, poput coomassie plave boje. Područja u kojima Pepsin ima hidrolizaciju podloge pojavljuju se kao bistri bendovi protiv plave pozadine.
Ciymografija pruža informacije o molekulirnoj težini pepsina i njegovih izoformama. Može se koristiti i za usporedbu aktivnosti Pepsina u različitim uzorcima. Međutim, to je kvalitativna ili polu-kvantitativna metoda i ne pruža tačne kvantitativne podatke o razini Pepsina.
5 Kromatografske metode
Hromatografske metode, poput visoke tečne hromatografije (HPLC) (HPLC) mogu se koristiti za odvajanje i kvantificiranje Pepsina. HPLC može odvojiti Pepsin iz drugih proteina i tvari u uzorku na osnovu njihovih fizičkih i hemijskih svojstava, poput veličine, punjenja i hidrofobičnosti.
U tipičnoj HPLC analizi, uzorak se ubrizgava u stupac ispunjen stacionarnom fazom. Mobilna faza se zatim prolazi kroz stupac, a različite komponente u uzorku su izbačene u različitim vremenima na osnovu njihovih interakcija sa stacionarnom fazom. Elute Pepsin može se otkriti pomoću detektora, poput UV detektora ili masovnog spektrometra.
Hromatografske metode mogu pružiti tačne kvantitativne rezultate i mogu se koristiti i za analizu čistoće uzoraka Pepsina. Međutim, oni zahtijevaju specijalizirana oprema i obučeno osoblje, a analiza može biti vrijeme - konzumiranje.
Kao PEPSIN dobavljač osiguravamo kvalitetu naših pepsinskih proizvoda kroz strogo testiranje pomoću ovih metoda otkrivanja. Naš Pepsin je visoke čistoće i aktivnosti, ispunjavajući različite potrebe naših kupaca u raznim industrijama, poput hrane, farmaceutskih proizvoda i biotehnologije.
Ako ste zainteresirani za naše proizvode Pepsina, ili ako imate bilo kakvih pitanja o otkrivanju ili aplikacijama Pepsina, slobodno nas kontaktirajte za nabavku i daljnju raspravu. Nudimo i povezane proizvode kao što suOrganski rižinski protein,GMP fabrički snabdevanje Prirodni biotin, iL Glutamin Doplata na veliko dobavljač. Radujemo se što ćemo sa vama uspostaviti dugoročnu i obostrano korisnu saradnju.
Reference
- Barrett, AJ, & McDonald, JK (1980). Metode u enzimologiji: proteolitički enzimi: aspartic i metallo peptidaze. Akademska štampa.
- Wilson, K., & Walker, J. (2005). Principi i tehnike praktične biohemije. Univerzitet Cambridge University Press.
- Lottspich, F. i Zorbas, H. (1998). Bioanalytics. Spectrum Akademischer Verlag.
